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设备基本已经定下来准备完毕，现在正进一步研究精子长期低温保存的技术。提供了一种低温保存精子的方法。该方法包括提供一种精子样品；将精子冷却到第一个温度；将精子样品保持在第一个温度下；将精子冷却到第二个温度；将精子样品保持在第二个温度下；和在第三个温度下贮存所述精子。这些方法可被用来长期低温保存哺乳动物的精子，这样放到普通冰箱里就可以了起码可以存放上个几年。
还有一个方法比较传统保存在液氮里，也就是－192度以下，（2）营养，要有卵黄或者精子培养液（稀释液），这样才能给精子提供继续存活的能量 。
人工受精全步骤
1、准备工作：
人工受精所有器械消毒结束后按顺序摆放在保温柜中，受精室内清洁消毒后将紫外线灯开20分钟
，准备好毛巾（种公狗消毒用）、两个水盆（一个盛放消毒种公狗的消毒水，另一个盛放消毒用 后器械的消毒水）、脏物桶，提前30分钟将水浴锅启动（加热稀释液到30℃），将室内温度提升 至20℃后，输精人员方可进入，人员着装后（白大衣、拖鞋、手套、帽子、口罩）即可开始人工 受精工作。
2、采精：
种公狗后，先用毛巾将种公狗胯下及臀部至后腿上部的毛擦湿（避免采精时落入灰尘），然
后采精，采出的精液连同集精杯应立刻放入加热好的水浴锅中，用胶头滴管吸取一滴精液进行显 微镜检测，检测合格的方可进行稀释。
注意：种公狗头两次采精精液活力较弱、死精较多为正常现象，是因为贮藏在睾丸里的精液时间 过长，不要惊慌，多采几次后即可正常。
3、输精：
母狗抓入后，先用医用棉签或手纸将母狗外阴部擦净，即可进行输精操作，输入后用一次性注射
器套上20号针头抽取1ml精液和1ml空气，将母狗垂直提起臀部朝上，把精液缓慢注入子宫。
注意：如果在拔出开膣器和输精针时发现带有脓性分泌物，请提醒狗主立即治疗，器械应单独消 毒处理。 犬的人工授精是指用人工的方法，将公犬的精液采取出来，通过严格的科学检查处理，用鲜精液或冷冻精液，输入到母犬的生殖器官内，使精子与卵子结合，达到繁殖优良犬的目的。
一、采精
1 ．采精的准备工作
（ 1 ）场地的准备，为了保证公犬有一个良好的性欲反射条件，必须选好采精的场地。采精场应宽敞、安静、清洁，并要彻底消毒。
（ 2 ）台犬的准备目前多采用发情的母犬作为台犬。采精前台犬的后躯、尾根部、外阴部、肛门部位，都应彻底洗涤清洁，再用消毒过的干抹布擦干。2 ．采精技术
（ 1 ）手握法当公犬爬跨，阴茎勃起时，采精人员一只手抓住龟头的球状部位之后，另一只手拿着容器收集精液。在收集精液时，要特别注意器具不能触及龟头，否则会造成射精停止。另外，采精手应在龟头的背部必须保持一定的压力。用这种方法采到精液，可直接给发情的母犬输精，不宜保存。
（ 2 ）假阴道采精法 首先应根据公犬的阴茎大小制作阴道，其结构主要由外壳、内胎、采精杯及附件组成。在应用时先在假阴道内胎中装上热水，其温度应保持 40℃。假阴道内表面不必润滑剂，因为发情母犬阴道略显干燥。当公犬爬跨母犬时，将阴茎导入假阴道内、也可以用手淫的方法，待阴茎勃起时，推进阴道，另一只手持龟头后的阴茎，助手轻轻地打气，使假阴道产生一定的压力，以便刺激公犬继续射精。
二、精液品质检查
1 .精液量
高加索的射精量，因其个体、年龄、采精方法、采精频率和营养状况等多种因素影响。射精量太多，可能是由于过多的副性腺泌物或其他异物混入，若过少可能是由于采精方法不当或生殖官功能衰退所致。发现这种情况就应该改进采精技术和方法，改进公大饲养管理或调整采精频率。
2 ．精液的色译大正常的精液为乳白色或灰白色，精子数量越多，乳白色越深。若精液呈淡绿色是混有浓液，呈淡红色是其中混有血液，呈黄色是混有尿液，凡属上述颜色的异常精液，应该丢弃或停止采精。 3 ．精子活率
是指精液中有改线前进运动的精子百分率，是评定精液品质优劣的重要指标之一，也称精子活力。检查方法是在载玻片上放1滴精液，用盖玻片压上，制成压片置于400倍的显微镜下观察。精子活率一般采用10级评分，即按精子直线前进运动的百分比评为10个等级： 100 ％前进者为 1 . 0 分，90 %前进的为0.9分，以下类推。
4 ．精子密度
是指精液的单位容积（1mL）内所含精子数目，是评定精液品质的一项重要指标，也称精子浓度。目前测定精子密度的方法主要采用估测法、血细胞计算器计算法 。
（ l ）估测法 此法通常与检查精子活率（不做稀释）同时进行，在显微镜下根据精子分布稠密程度粗略地分为“密”、“中”、“稀” 3 级。
① 密; 整个视野充满精子，精子之间的空隙小于 l 个精子，看不见精子的活动情况，这种精液每毫升含有精子 10 亿以上。
② 中; 精子在视野中比较分散，精子与精子之间的空隙约与精子本身长度相等，可以分清精子活动情况，这种精液每毫升含精子 3~10 亿。
③ 稀; 在视野中只能见到少数精子，精子之间的空隙很大，这种精液每毫升含精子在 2 亿以下。
（ 2 ） 计算法; 用血细胞计算器，在显微镜下计数，是比较准确的方法是先用血细胞吸管稀释精液之后将精液稀释20 倍时，用血红细胞吸管稀释：把精液稀释成 200 倍时，则用血红细胞吸管稀释。稀释液用 3 ％的氯化钠溶液，以杀死精子便于计算，其计数方法与血细胞计数相同。
5 ．精子的畸形率
是指形状不正常的精子。畸形情子种类很多，如头部巨大、瘦小、细长、圆形、轮廓不清、皱缩、缺损、双头等，颈部膨大、纤细、屈折、双体等，主段弯曲、屈折、回旋、短小、长大、缺陷、带原生质滴、双尾等，精液中的畸形精子的比率越高，受孕率就越低。一般认为，犬精子畸形率不得超过 20%。
6 ．精子的存活时间及存活指数
是指离体精子在一定条件下的寿命，这是判断精子受精能力的一项指标。将精液采出后，应立即稀释1: 2 ~3 倍，将稀释精液置于一定的温度（0℃~37℃ ）下，间隔一定时间检查精子活率，直至无活动精子为止，所需的总小时数为存活时间；两相邻2次检查的平均活率（即 2 次活率相加÷2 ）与间隔时间的积相加总和为生存指数。精子的存活时间越长，指数越大，说明精子活力越强，品质也越好，受精率也越高。
7. pH 值的侧定
测定的方法是用万能试纸比色或电动比色来侧定，犬的精液ph值平均为 6 . 4 （ 6 . 1~7 . 0 ） , pH 值的高低与副性腺分泌物有关，第一部分精液 pH 值居中、第二部分精液的 pH 值最低；第三部分精液的 pH 值最。pH值偏低的品质较好， pH值偏高的精子活力、受精力都显著降低。
三、精液的稀释
精液稀释的目的在于增加精液的容量，扩大配种头数。稀释液的成分很多．大致可分为以下 4 类。
1 ．稀释剂
主要用以扩大精液容量，如等渗氯化纳溶液、等渗葡萄糖溶液等。
2 ．营养剂
器械消毒
1、玻璃、金属器械消毒：
第一步：用洗衣粉或洗涤剂刷洗，目的是去掉油污。
第二步：用清水涮净，目的是去掉残留的洗衣粉等碱性物质。 第三步：放入烤箱或烘干箱内烘烤，直到将器械上的水分全部烤干为止，目的是将水分蒸发和高 温灭菌。
注意事项：输精针的刷洗必须用20ml以上的注射器推洗一遍，还需注意针头部位的刷洗；试管必 须用试管刷仔细反复刷洗，尤其是管的底部；吸管用胶头吸水反复冲洗。
2、塑料器械消毒：
第一步：用洗衣粉或洗涤剂刷洗，目的是去油污。
第二步：用清水涮净，目的是去掉残留的洗衣粉等碱性物质。 第三步：消毒水（1/1000以上浓度的新洁尔灭或百毒杀溶液）浸泡30分钟以上，目的是杀菌。 第四步：清水（有条件的最好用蒸馏水）涮净，目的是去掉残留的消毒水。 第五步：将水分甩干或放入保温柜烘干。
注意事项：开膣器（扩张器）必须用小试管刷通入内部仔细刷洗，尤其是管的前端。 消毒过的器械应该立即放入事先消毒好的医用托盘中分别盛放，并将医用托盘放入保温柜中备用 。使用前先将保温柜的温度升至30℃左右方可使用。摆放的顺序为：输精针、开膣器、集精杯、 胶头滴管、载玻片、盖玻片、玻璃试管、一次性手套、一次性注射器。 输精技术要点
1、判定子宫颈：
将开膣器插入母狗阴道最底部，用大拇指和无名指分别固定子宫颈的两侧。
技术要点为：向斜下方压开膣器，先摸开膣器的头部然后在过管头1cm范围内摸到花生粒至黄豆粒 大小的凸起，随着开膣器的运动而运动，即可判定为子宫颈。
2、固定子宫颈：
大拇指和无名指分别固定子宫颈的后上方，两指尖没接触到子宫颈的部分卡的力要大一些，目的
是拦住子宫颈自然向上回弹的力。两指接触到子宫颈的部分不要太用力，达到能感觉到子宫颈的 力即可，目的是方便判断进针时针的所在位置。
3、进针：
将输精针通过开膣器缓慢放入阴道尽头，详细部位应该是子宫颈下方，确认位置后将输精针沿着
子宫颈的形体往回撤针，当针回至子宫颈高度的下1/3时，试着向前推针，如果感觉针在相同阻力 的情况下不断前进，进入3－4cm深度时即可停止。 该项学习要点在于对输精针所在位置的判断，要做到每一次进针、退针都要知道针的位置，只有 练习好这项基本功，才能避免进针的盲目性。其次在于对针的回退浴前进所需要的距离和力量的 规律性的掌握，达到这两点的配合熟练，也就掌握了输精迅速的方法。
4、判断输入的方法：
（1）针的插入与拔出阻力一致（如果感觉阻力很大，单凭此点即可判定）。
（2）子宫颈被穿在针的粗细结合部。 （3）针的细部穿过子宫颈后3－4cm。 （4）针的细部被子宫颈所包住，所以变粗并且有肉的弹性。 （5）沿着针头向前继续摸1－2cm，可摸到两侧子宫角的分叉处随着针的晃动也跟着晃动（单凭此 点即可判定）。
5、判断输漏的方法：
（1）针没深入之前阻力大，忽然间阻力全无，向前挺进3－4cm，插入与拔出均无阻力。
（2）子宫颈没被穿在针的粗细结合部，而是感觉在针的侧面。 （3）针的细部依旧摸着很细，并且没有肉的弹性感，而是钢的坚硬感。 （4）拔出体外后，在白纸和白布上擦有明显的血迹。 （5）针头前方摸不到两侧子宫角的分叉处，没有子宫角随着针晃动的感觉。 人工受精的准备
人工受精的准备工作是人工受精工作的前提，有了完善的人工受精准备才可能有人工受精工作的成功。它
包括人工受精室的建立、器具（器械）的准备、人员的组织与培训、选种健康状况的要求等项工作组成。
（一）人工受精室的建立
人工受精室建立的好坏，直接影响精子的活力和操作上的卫生条件。因此，人工受精室应具备以下几个条
件：
1、房屋的选择。 应选择宽敞明亮，易于清扫消毒（地面及四壁应光滑耐潮），并且保温性能良好，周围
环境安静的房间。它的面积不得小于10m2，也不宜过大。房间的高度也不宜过高，以利于保温和房间各处
的温度均等（相近）。
2、房间布置。
（1）铺置地板革、地板砖。这样有利于彻底消毒。因为，地面缝隙较少，不易存污垢。
（2）为了提高保温能力可以在四壁钉置塑料薄膜。薄膜距墙壁应保持10—20cm距离。
（3）供暖应清洁卫生。一般用电供器供暖。有条件可安置空调。室内温度应保持18—25℃范围内。
（4）消毒设施：可安置紫外线灯或进行光线消毒。
（5）照期设施：日光灯即可。
（二）器具的准备以及用途
1、电器类；（1）恒温箱：放置人工受精器具（离心管、集精环、滴管、输器、扩张器、载玻片等），使其预热至36～38℃。（2）水浴锅或保温桶：存放精液水温保持在36～38℃。（3）电冰箱：0～5℃保存稀释液。也可用于保存当天多余的精液次日使用。（4）显微镜：用于精液检验和脱落角化细胞检查。（5）高压灭菌器：消毒玻璃、金属器具。（6）烘干箱或电烤箱：玻璃、金属器具、消毒、烘干。
2、输精器械：输精针、扩张管：当天受精母狗应每只一套。
3、采精器械：采精台、集精环、离心管或试管。
4、其它器械：量筒、滴管、载玻片、棉纱缸、消毒盘、垃圾桶。
公狗采精技术 狗人工受精第一步是采集公狗的精液。主要包括采精前准备。采精操作技术，采精频率和应注意事项
1、采精前的准备：首先是公狗的消毒，可先用肥皂水清洗公狗的阴部（阴茎、阴囊），因为此处油污较多。然后用清水冲净，再用1/1000百毒杀或新洁尔灭将公狗腹部毛浸湿。干湿程度应以不往下滴水为准。过湿消毒液则会滴到集精杯内杀死精子。过干则会使一些灰尘及被毛落入精液。造成污染。消毒液的温度应在40～50℃之间。因为温度过低会造成公狗性欲降低。
2、采精操作技术：历史上呈有过以下几种采精方法：手按摩法、电刺激采精法、假阴道采精法、手按摩假阴道混合采精法。经几十年的实践，国外狗人工受精最常用、最有效、对公狗刺激最小的方法是手按摩法。手按摩采精法：将公狗放在保定架内或辅助人员将狗保定好，辅助人员一手握颈钳夹住头颈部，另一手握住尾部，并将尾部适当提起，使公狗呈站立姿势。进行消毒后稍等1～2分钟，采精时左手握集精杯，右手轻轻按摩其阴茎，待勃起时把公狗阴茎由其两后腿中间拉向后方。左手作好接精准备，再快速按摩数次，即可出现射精。注意：①采精时动作的辐度与力度不能过大、过重。以免损伤阴茎，并可防止振落被毛和皮屑落入集精杯内，污染精液。②当把公狗阴茎拉到后方后，应按摩阴茎球后方部分，动作尽量轻快。③集精杯一定要握全，保持与手温相同。④采精者手部不可过凉，以免降低公狗性欲。⑤射精的最先始，多混有尿液等杂物，不可接入集精杯。⑥采完精后应轻轻把充血的阴茎球按回原状，并把阴茎复位。
3、采精频率：应根据精子产生的数量决定。一般来说射精量大的频率宜低，但又因为不同个体间差异也大，耐高采精频率的能力主要是受遗传影响。而饲养管理也有一定影响。
检查精液品质（品质鉴定） 采取的精液必须立即进行。评定其质量，以便取舍，一般由以几种方法进行。
1、直观检查 （1）射精量：射精量就是雄狗一次采精所射出精液的容积。狗的射精量一般在0.5～5.5ml左右。（2）色泽：正常应为乳白色，灰白色的精液表示精子密度稀薄，但也是正常的。如呈淡红色表示混有血液。精液有黄色或淡绿色是含有浓汁或混入尿液的表示。（3）气味：刚采出的精液略带腥味，这是正常的，如带其它异味则不正常，应废弃。
2、显微镜检查：
（1）精子活力：精子活力与精子的受精能力有密切关系。
方法：在载环片上滴一滴精液再用盖玻片盖在精液上面，使精液分布均匀。进行观察。观察视野中具有直线运动的精子数目有多少，占视野内精子总数的百分之多少。用于输精的精子活率不可低于60%（放大400倍观察）。
（2）精子的密度：是在一定体积精液中精子的数量。单位（亿/ml）品质优良的精液密度较大。测定的方法有以下两种。
①估测法：与测定精子活力同时进行。在视野中的精子数×100万×稀释倍数=原精密度
如：稀释后视察（稀释5倍） 视野中有60个精子。那么原精的密度为：60×100万×5倍=30亿/ml
②计数法：运用血细胞计数器计数，使用红细胞吸管。
方法：用吸管吸取原精液至所需要的度，然后吸取稀释液至101的刻度上，以拇指和食指分别按压吸管的两端，进行振荡混合均匀，而后弃去吸管前段不含精子的1～2滴，再向计数室与盖玻片之间的边缘滴一小滴，使精液渗入计数室内，即可在显微镜下检查计数，数出5个中方格（选择有代表性的四个角及中央各选一格即80个小方格）。计数室有中方格25个，每个中方格有16个小方格，整个计数室共有400个小方格。计数精子时，只需要查数5个中方格的精子数，而后推算1ml内的精子数，可按下列公式求出
5个中方格的精子总数÷80（小方格数）×10（计数室高度）×200（稀释倍数）×400（小方格数）×1000（1ml=1000mm3）=1ml原精液的精子总数
为了减少误差，最好进行两次计算。如果两次误差大于10%，则应作第三次计算，然后计算出平均数。为了简便数量的测定，可将数出5个中方格的总数×100万即为1ml原精液的精子数量。
（3）精子畸形率：畸形精子又叫变态精子。正常公狗精液内精子畸形率不应超过20%，如超过20%则应废弃。
①畸形精子的种类：巨型精子、短小精子、双头或双尾精子、头部或尾部残 缺、尾部弯曲或弯向一侧、精子各部彼此粘连以及带有原生质滴的精子等。
（4）有效精子数：具有受精能力的正常精子数量。
计算公式：原精总数×精子活力（%）=有效精子数 根据计算出的有效精子数即可得出可输母狗只数。 公式如下： 可输母狗只数=有效精子数÷输精量/只母狗。
精液的稀释 精液在保存和输精之前，都要进行稀释，它可以增加精液数量，扩大配种只数，还可补充精子代谢所需的营养。消除副性腺分泌物对精子的有害影响。缓冲精子的酸碱度，给离体的精子创造适宜的环境，从而延长精子在体外的生存
此种人工输精方法是用开膣器插入阴道，将阴道打开，借助一定的光源（手电、额镜、额灯等），寻到子宫颈外口，然后把吸好的精液的输精器插入子宫颈外口内1至2厘米，将开膣器稍后撤，并注入精液。随之取出输精管和开膣器。这种方法比较直观，能看到输精管插入子宫颈口的情况，缺点是：①由于开膣器对母狗阴道刺激较大引起稍微痛感，，输精不方便，阴道狭窄的处女母狗容易使阴道粘膜受伤，有时插不进阴道 | 
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